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翻译组自推出以来,受到了市场广泛的关注,我们也是收获了一大批 fans.但是对于 Ribo-seq 的应用,多数人还是局限在差异基因和差异蛋白不符,即翻译效率的分析上.但是今天小编告诉您,他的功能远比您想象的要强大.今天就来跟大家分享, 怎样结合 Ribo-seq 技术,高精度解读翻译过程.

Ribo-seq 技术测定的多聚核糖体结合的 mRNA 片段,长度约30nt.通过 reads 分布,可直观预览正在高效翻译的区段(5'UTR/CDS 和 3'UTR).除此之外,结合其他测序和分析手段,还能让翻译的定位精度瞬间提升一个 level.比如最新发表在  Molecular Cell  的"Translational Control through Differential Ribosome Pausing during Amino Acid Limitation in Mammalian Cells'和发表在 PNAS 的"Transcripts from downstream alternative transcription start sites evade uORF-mediated inhibition of gene expression in Arabidopsis'.分别利用 MNase 的 monosome profiling 和CAGE(基因表达帽分析)将翻译过程深化到密码子精度.

Alicia M. Darnell 等发表在 Molecular Cell 的研究工作,关注的是在精氨酸/亮氨酸限制条件下,人类细胞系在转录和翻译水平的响应机制.在真核细胞中,限制氨基酸可以由两个保守性信号通路感应:雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)和一般性调控阻遏蛋白激酶 2(GCN2) .两信号通路可对20种氨基酸限制同时响应,但对每一种氨基酸的反应程度却有所不同.由于肿瘤细胞对某些特定氨基酸存在依赖性,所以有必要揭示这些 mTORC1 和 GCN2 响应是怎样整合的,在特定氨基酸限制条件下是否足够调节蛋白质合成?

作者首先结合 monosome profiling,通过核糖体暂停程度计算(约61个有义密码子窗口下,核糖体印记的标准化平均密度的净增量),发现三个细胞系在限制精氨酸时,六个精氨酸密码子中的两个(CGC和CGU)密码子核糖体密度大幅增加.限制时间越长,增加的幅度越大,由此推测在此密码子位置发生了核糖体暂停(ribosome pausing)的现象.限制亮氨酸时,则无显著核糖体暂停现象发生(图1).

图1 限制精氨酸而非亮氨酸发生特定密码子位置核糖体暂停现象

A-C:HEK293T/HCT116和HeLa细胞中,限制精氨酸/亮氨酸3h或6h时,特定密码子位置的核糖体密度.D-E:每个细胞系限制精氨酸3h后,精氨酸密码子使用频率(D)或同源精氨酸tRNA基因拷贝数(E)与核糖体密度的关系.

核糖体暂停对应翻译延伸过程的中止,而延伸的进行离不开 tRNA 的转运作用.通过 tRNA charging 分析,发现限制精氨酸不仅促进发生了核糖体暂停,相应密码子对应的 tRNA 装配缺失率也显著提高约1倍.而这可能与感知氨基酸含量的 GCN2 和 mTORC1 有关系.限制精氨酸抑制了 mTORC1 而激活了 GCN2.通过分子生物学手段激活 mTORC1 或敲除 GCN2 之后,作者发现两通路对氨基酸限制的响应程度不足,对应加剧了核糖体暂停和 tRNA 装配缺失.

而不论是 GCN2 和 mTORC1 激酶调控的翻译起始阶段,还是核糖体暂停发生的延伸阶段,都会对蛋白质的合成速率造成影响.精氨酸限制条件下,蛋白质合成速率大大下降.通过 Ribo-seq 分析发现限制精氨酸时,转录本上的核糖体密度相对较大.此外,在 HEK293T 细胞中,限制精氨酸比限制亮氨酸时 mTORC1 活性高,蛋白质的合成速率却没有提高.由此推测,是翻译的延伸速率下降,导致了蛋白质合成速率的下降.

那么核糖体在 mRNA 特定位点的暂停会对编码蛋白产生什么样的影响呢?作者接下来利用荧光蛋白信号,追踪限制氨基酸条件下,蛋白质的合成过程.发现核糖体暂停导致了翻译的提前终止,由此降低了蛋白质的合成速率.

说完了翻译的暂停位点,我们再来看看 Yukio Kurihara 最近发表于 PNAS 的论文,又是 怎样 解析转录起始位点(TSS)与翻译之间的关联的 .

已有研究指出,当拟南芥籽苗暴露于红光时,会改变 TSS 而发生选择性转录.那么在蓝光(BL)条件下有相似的现象发生吗?其作用原理又是怎样的?由此,作者先通过CAGE法抓取全基因组范围内的TSS,解析 TSS 的动态变化.发现蓝光处理会促进220个基因的 TSS 从 uORF 上游(uTSS)向下游(dTSS)的转变,此过程由转录因子 hy5 参与完成(图2).而这些基因不全都是差异表达基因(RNA-seq).那么TSS选择性转录的发生,极有可能对应调控的是蛋白水平.

图2 基因组范围内避开uORF转录的现象

(A)BL促使CTCs峰值发生位移;(B)以HPR1为例说明(A)的发生;(C)uTSS和dTSS之间uORF的长度分布;(D)WT-dark/WT-Blue/hy5-Dark和hy5-Blue中利用uTSS和dTSS的2308/2779/2311和2384个基因中dTSS/uTSS TPM值的变化情况.

选择5个 BL 诱导 dTSS 转录的基因,在体外小麦胚芽翻译系统中,测试会被 dTSS 起始而避免 uORF 调控的翻译过程.在这些基因的 5'UTR 融合一个 venus 报告基因,并通过定点突变将 ATG 突变为 TTG,从而去除 uORFs( uORF - ).在这些基因中,点突变增加了 venus 报告基因的积累,表明 uORF 具有抑制下游序列翻译的作用.Ribo-seq 结果也表明,BL 处理下 uORF 与下游 mORF 的翻译呈负相关:BL 诱导 dTSS 转录本的翻译效率上调(TE:结合RNA-seq定量结果计算而得),而 uORF起始的转录本则下调(图3).

图3 BL诱导dTSS起始转录并避免了uORF对mORF翻译的负调控

(A)转录组的平均reads与翻译效率差异倍数相关性分析(B)BL诱导增加的uORF-avoiding基因(黑色)和所有基因(灰色)翻译效率差异倍数的积累曲线(C)BL诱导发生uORF-avoiding基因中44个uORF和对应mORF翻译效率差异倍数的箱型图.

那么拟南芥发生此调控现象的意义何在呢?结合报道指出,位于 mRNA5'UTR 的 uORF 会诱导发生 NMD.所以,黑暗处理下,uTSS转录产生的 mRNA 可能会因为 NMD 被降解掉,从而避免不必要的蛋白产生.为了证实这个猜想,作者构建了可以修复 NMD 的 upf-1 突变株.相对 WT,upf-1 突变株内有876个转录本显著增加.其中357个基因由 uTSS 而非 dTSS 起始的转录增加.与BL诱导增强了 dTSS 转录的基因相比(200个基因),只有45个 overlap,包括 HY5 和 AT1G64680.这项实验结果表明,BL 诱导的 uTSS-dTSS 转变基因中,有一小部分 uTSS 转录产生的转录本被 NMD 负调控了.

怎样提高翻译过程的分析精度,您学会了吗?后续请继续关注ribo-seq的其他功能哦!To be continue…

艾德思

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