人类大脑纺锤形神经元转录图谱获解析激光显微切割技术功不可没,EditSprings,艾德思



　　中科院昆明动物研究所日前宣布,该所宿兵研究组与中南民族大学中国人类脑库中心开展合作,利用激光显微切割和微量样本RNA测序技术,解析了来源于人脑前扣带回纺锤形神经元的转录图谱.该项目得到中科院先导专项和国家自然科学基金委重点项目的资助,相关成果已发表于国际知名神经生物学刊物

Cortex>上.

本文引用地址: 　　项目介绍

　　研究表明,旧大陆猴/猿类和人类等灵长类大脑进化出一类新的神经细胞,称为纺锤形神经元(VEN),人类大脑中的VEN数量是最多,但在新大陆猴等更原始的灵长类中则没有这类神经元存在.神经生物学家猜测VEN可能参与人类社会认知能力等的高级认知功能,但由于VEN在大脑中分布的局限(仅集中分布于前脑岛和前扣带回两个脑区)以及技术上的局限性,人们对VEN的确切功能几乎一无所知.因此,构建该类细胞的转录图谱是了解细胞功能的一个重要基础性工作.

　　宿兵研究组利用激光显微切割和微量样本RNA测序技术,发现了300多个VEN特异表达升高或降低的基因,并鉴定了4个新的VEN标记基因.对转录组数据的进一步分析发现,这些基因与VEN的形态发育(如树突分支和髓鞘化等)和功能(如人类社会情感类疾病等)都密切相关.人类VEN转录图谱的解析,为了解这类在灵长类大脑进化和人类大脑起源中扮演重要角色的神经元提供了重要的基础数据,也为研究人类神经精神疾病(如自闭症等)的发病机制提供了重要信息.

　　在这项研究中,激光显微切割技术对分离细胞/提取RNA起到了重要作用.

　　 激光显微切割技术发展历程

　　显微切割技术是90年代初发展起来的一门新技术,它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个/几十个同类细胞,甚至是单个细胞,再进行后续相关的分子生物学方面的研究如PCR/实时荧光定量PCR/蛋白质组学和其他分析技术.显微切割的发展经历了手动直接显微切割/机械辅助显微切割/液压控制显微切割和激光显微切割4个阶段.

　　激光显微切割平台

　　图片来自 徕卡显微系统官网

　　1996年,美国国立卫生院国家肿瘤研究所的首次开发出基于近红外激光熔膜原理的激光捕获显微切割技术,用于动物细胞的切割和DNA/RNA分析.次年,美国Arcturus

Engineering机构成功研制激光捕获显微切割系统,并实现商品化销售.又过了5年之后,激光捕获显微切割才在植物研究中成功应用,此后这一技术在生物研究中迅速发展并被广泛应用.激光显微切割技术可将显微镜下观察到的目标细胞直接用激光取出,与早期技术相比,这种技术有着快速/简单/精确/特异性强/准确度高/细胞形态保持完好/细胞内分子结构保持完整等优点.

　　激光显微切割原理

　　目前激光显微切割从激光类型和技术原理上可分为两种,分别是基于近红外激光(810nm波长)的LCM

(激光捕获显微切割)和基于紫外激光(337～355nm波长)的LMD(激光显微切割)两种.前文所提的纺锤形神经元转录图谱项目,采用的就是LCM技术.

　　LCM

系统包括倒置显微镜/固态红外激光二极管/激光控制装置/控制显微镜载物台(固定载玻片)的操纵杆/电耦合相机及彩色显示器.用于捕获目标细胞的热塑膜(乙烯乙酸乙烯酯,EVA)直径通常为6mm,覆在透明的塑料帽上,后者恰与后继实验所用的标准

离心管相匹配.

　　LCM技术的原理是在组织切片上方悬着机械臂控制的收集管,收集管的塑料帽表面有一层的热塑膜(其最大吸收峰接近红外激光波长),在显微镜下选择好目标细胞后,发射低能红外激光脉冲,瞬间升温使EVA膜融化与目标细胞黏合再迅速凝固.接着目标细胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并随着塑料帽一起移走.

　　机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽,放到脱水组织切片上的目标部位.显微镜直视下选择目标细胞,发射激光脉冲,瞬间升温使EVA膜局部熔化.熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中,并在几毫秒内与目标细胞黏合并迅速凝固.激光脉冲通常持续～毫秒,并且可在整个塑料帽表面进行多次重复,当组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力,就可以迅速分离大量的目标细胞.将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上,分离的细胞就转移至离心管中,从而可以分析出目标细胞的分子生物学特征,用于进行后续研究.

　　EVA膜约100～200μm厚,能够吸收激光产生的绝大部分能量,在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C,保持数毫秒后又迅速冷却,保证了生物大分子不受损害.采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生.

　　LCM的优点在于快速/简单/精确/无污染,而且适用任何玻片类型,尤其是采用能量较低的近红外光,不直接接触样品,激光发出的大部分能量都被热塑膜吸收,对样品影响较小.

　　而LMD技术则需要将标本切片装片在薄膜载玻片或者薄膜覆盖的玻璃载玻片上.脉冲紫外激光(UV-A)通过物镜聚焦在切片上,沿着目标区域的边缘移动切割,使选择区域内的细胞脱离下来且周围组织完好.由于紫外激光的波长和生物组织的吸收峰非常接近,故常用于切割较厚的样品组织.

　　激光显微切割技术应用现状

　　目前,激光显微切割技术较以往的显微切割技术有了突破性的进展,现已广泛应用于神经科学/癌症研究/植物分析/法医学或气候研究等领域.该方式同时也适用于细胞培养的操作或盖玻片的显微雕刻.尽管应用日趋广泛,但也有一些问题亟待解决,例如设备成本/进行组织切片时需要通过固定和染色才能进行细胞的形态学观察,可能会影响细胞的状态以及RNA/蛋白质的变化等.

　　目前市场上主要有四家机构提供激光显微切割的平台,分别是美国赛默飞世尔/德国徕卡/德国蔡司和瑞士MMI,而推出世界上第一台商用激光捕获显微切割系统的Arcturus则于2010年被赛默飞世尔收购.赛默飞世尔的旗舰产品ArcturusXT是唯一将基于红外的LCM和基于紫外的LMD激光切割融为一体的显微切割仪器,而蔡司/徕卡和MMI都只能使用紫外激光对目标细胞进行切割和收集.

　　ArcturusXT激光捕获显微切割系统有着开放的平台,能够升级并扩展应用以满足不断变化的研究需求.例如其开放的显微镜接口能让用户修改系统,可增加高分辨率的照相机以获得更精确的影像.开放的系统设计还实现了载物台插板的轻松互换,可容纳不同的样本形式,如神经生物学研究所用的更大玻片.

　　徕卡提供LMD6500和LMD7000激光显微切割系统,利用紫外激光分离显微镜头之下的目标区域,并通过重力这种温和的方式来收集样品.在徕卡的两款系统中,均使用高精度的光学组件来控制激光束移动.光束焦点有自动修正功能,可在全自动模式和交互模式中切换,同时显微镜样品台和样品本身保持不动.通过这种专利方式,可以达到超乎想象的精度.

　　瑞士MMI机构主推CellEctor Plus单细胞分选系统和CellCut

Plus激光显微切割系统,利用固态紫外激光对组织切片等样本中的目标细胞进行切割和收集.在整个分离过程中,激光都不与需要分离的样本接触,对样本损伤小,从而保证了样本RNA的完整性.此系统在样本收集时采用PTP(Predefined

Target

Positioning)技术,将黏性管盖划分成若干区域,对组织切片中同种类型细胞进行黏附收集,提高样品的收集效率,节省成本;通过计量统计可保证下游的核酸/蛋白实验有足够的样本量.

　　蔡司的PALM

MicroBeam也是利用聚焦激光束来切割和分离样本,不过它收集样本的方法比较特别.通过一种激光诱导的压力波将细胞弹入管中.MicroBeam的弹射力就好像在您的样品下方发生光诱导的微型爆炸,随之而来的冲击波向上推动组织.对于较大的区域,MicroBeam也可以使用粘性管盖.

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