艾德思：专家点评Nature日本科学家突破体外扩增造血干细胞瓶颈

说起造血干细胞领域的holy grail(圣杯),毫无疑问,同行肯定会一致认为是解决体外扩增并维持造血干细胞功能的问题.但是围绕造血干细胞体外扩增的问题,每年总会有那么一两篇具有轰动效应的成果出现.然而,近期日本科学家的一篇发表在 Nature 上的成果让不少人激动不已,许多人甚至认为造血干细胞领域的holy grail貌似要被拿下了,然而笔者接触的多位血液领域的权威专家纷纷对该工作有强烈的质疑,真可谓"墙内开花墙外香'.那么到底日本科学家是否解决了造血干细胞领域的核心重大科学问题呢?BioArt本着对学术负责任的态度,除了常规进行解读之外,还邀请了国内血液领域的权威专家 程涛 教授以及另外两位不愿透露姓名的权威专家对相关工作进行了点评,希望读者能有清醒的认识和思考.

具有多能性且能够自我更新的 造血干细胞 (Haematopoietic stem cells, HSCs) 在移植之后可以重建受体血液系统 {1} ,这是目前为止多种疾病包括自身免疫疾病和白血病的有效治疗方案 {2} .尽管在二十多年之前就已经可以成功分离出造血干细胞 {1} ,但是在体外维持造血干细胞的扩增却囿于技术限制一直没能很好地发展起来,并长期存在一些争议.

2019年5月30日,来自斯坦福大学的 Hiromitsu Nakauchi 与东京大学的 Satoshi Yamazaki 研究组联合在 Nature 发表篇论文,题为 Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation ,通过一系列优化实验筛选得到了最适合的造血干细胞体外大量扩增的条件,为治疗血液病带来了曙光.该新闻经过很多媒体报道之后,有很大的轰动效应,但是该成果是否得到了同行专家的认可却非常难说.

在分离出造血干细胞之后的二十多年中,造血干细胞的体外大量扩增培养的研究一直都在进行.虽然已经在体内鉴定出了一些骨髓造血干细胞的维持因子 {3} ,但是在体外进行的大量扩增却还并不可行.为了优化造血干细胞的体外扩增培养条件,作者们首先选择不同浓度的促血小板生成素 (Thrombopoietin, TPO) 与干细胞因子 (Stem-cell factor, SCF) 在体外培养CD34−KSL细胞七天后,进行竞争性移植实验,移植后16周对受体外周血进行检测,发现100 ng/ml TPO与10 ng/ml SCF培养条件下的造血干细胞可以在受体体内形成最高的嵌合比例 () (图1) .

图1 高水平的促血小板生成因子素与低水平的干细胞因子能够提高造血干细胞的扩增

随后,作者尝试了将体外培养时间由7天延长到了28天,发现造血干细胞可以扩增到13000倍.由于在体外培养涉及到培养基替换问题,于是作者采用了两种方案:即每三天全部替换和半替换,发现全替换更有利于维持干细胞的干性.由于在替换培养基的过程中,需要离心以将HSC贴附,所以研究人员假设是否不同的平板涂层剂也对HSC的干性维持产生作用,于是尝试了5种不同的平板涂层剂,最后发现纤连蛋白 (Fibronectin) 能够最大程度的长期体外培养过程中促进造血干细胞功能的维持.

图2纤连蛋白Fibronectin作为平板涂层剂能够极大程度上促进造血干细胞的体外的扩增

在造血干细胞的培养中会出现一些细胞因子和趋化因子的变化,这被认为是造血祖细胞的污染,可能是由于一些诱导分化的因子溶解进入培养基中.作者们使用的造血干细胞培养基中包含酵母衍生重组人血清白蛋白 (Human serum albumin, HSA) .因此,他们认为可能是此种重组蛋白的使用是造成炎症反应的原因,因此该培养体系中的HSA需要被更优良的试剂替换掉.通过筛选11个可能的替换剂后发现,只有 聚乙烯醇 (Polyvinyl alcohol, PVA ) 能够支持造血的存活和生长并且维持造血干细胞和祖细胞的表型,并且也有前人的研究中提到将聚乙烯醇加入胚胎细胞的培养之中 {4} .

至此,作者们将体外长期培养造血干细胞的优化条件确定如下:培养液中包含100 ng/ml TPO, 10 ng/ml SCF 以及87% PVA并且表面涂层使用纤连蛋白 (图3) .此种优化后的条件能够最大程度上保留造血干细胞的功能并提高培养的性价比,使得体外大量培养造血干细胞成为可能.

图3 造血干细胞体外长期培养优化后的培养条件

总的来说,Hiromitsu Nakauchi 与Satoshi Yamazaki研究组 开发了一种无白蛋白的体外培养条件,能够有效地提高造血干细胞在体外培养扩增,在造血干细胞的研究中具有广泛应用的潜力.一直以来,造血干细胞的培养成分优化不足,再加上培养基中存在的杂质造成了体外大量扩增造血干细胞存在巨大的障碍.该研究极大程度上优化了体外长期且大量培养造血干细胞的培养条件,并且不需要使用有毒性的辐射预处理,为血液病患者的治疗提供了可供参考的更安全/更低价的治疗方法.

专家点评

程涛 (中国医学科学院教授/教育部"长江学者",国家"杰青")

随着造血干细胞(HSC)移植策略和移植方案的不断创新和改进,特别是半倍体移植的开展显著缓解了HSC供体来源短缺的问题,目前临床HSC移植正在快速地发展和普及.但是HSC的体外扩增对于进一步改善预处理方案/脐带血HSC移植和HSC基因治疗等方面的应用仍然具有重要的临床意义.怎样在体外建立HSC有效培养扩增体系一直是困扰HSC基础研究和临床应用的 世界性难题 .以往的HSC体外培养和扩增体系主要是以无血清培养基为基础/添加多种细胞因子和小分子化合物的"鸡尾酒'样的培养系统,有的扩增体系还涉及基因操作和基质细胞共培养.但是 以往各类扩增方式的并没有在临床上获得成功应用.    

来自日本东京大学的Satoshi Yamazaki副教授和美国斯坦福大学的Hiromitsu Nakauchi教授最近在杂志上发表研究文章,通过对HSC体外培养体系中细胞因子成分及浓度测试/培养板的处理和优化/培养时间的比较和多种高分子化合物的筛选,建立了一套能够在体外高效扩增功能性HSC的培养体系.他们针对高度纯化的小鼠HSC,利用筛选到的高分子化合物聚乙烯醇(PVA)代替血清白蛋白,添加优化后的高浓度促血小板生成素(TPO)和低浓度干细胞因子(SCF),在体外经过28天的培养实现236至899倍功能性HSC的扩增.同时,这一长期的体外培养体系产生的HSC也并未出现显著的衰老表征或者抑癌基因的突变. 与以往研究结果相比,这一相对简单而未涉及任何基因操作和不含基质细胞共培养的体系所取得的扩增效果非常令人振奋,不仅为HSC体外培养研究提供了一个新的实验系统,而且也给人HSC扩增的临床应用带来了新的希望.    

当然,随之而来的相关问题也值得思考和需要进一步研究. 这篇论文主要利用小鼠HSC进行研究,这一新的体外培养体系对人HSC体外扩增的效果还不够显著,亟需进一步优化培养体系和功能验证.此外,PVA扩增HSC的分子机制也需要阐明.再者,经历了体外28天的培养后/功能性HSC的增加是HSC直接的所谓"扩增',还是通过其它间接机制累积的结果也值得探讨.

造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的长期体外培养和扩增一直是困扰科学家们的世界级难题.主要问题是随着HSC的体外培养,由于脱离了体内"滋润'的微环境(niche)的呵护,加上外界细胞因子等营养成分的刺激,导致在细胞数目增加的同时伴随的是长期血液重建能力(干性)的下降甚至丢失.

Nature 近期发表了由斯坦福大学医学院Hiromitsu Nakauchi实验室和东京大学医学研究所Satoshi Yamazaki实验室合作的研究文章,报道了一种看似非常简单的小鼠骨髓HSC的长期体外扩增体系.研究人员首先利用竞争性骨髓移植实验优化了HSC体外培养的细胞因子TPO和SCF的浓度,发现100 ng/mL TPO和10 ng/mL SCF条件下培养7天的HSC具有最高的血液重建能力. {值得注意的是,该组合和文中设置的其它实验组(如50 ng/mL TPO和100 ng/mL SCF)是否在统计上存在显著性差异并未提及} 作者随后发现与体外培养7天的HSC条件培养基相比,培养14天的HSC条件培养基中富集了大量的细胞因子和趋化因子,包括IL-6/CCL2/CCL3和CCL4等;而且这些细胞因子的分泌依赖于Tlr4介导的固有免疫反应激活.重要的是,作者发现利用Day-12条件培养基培养7天的HSC与用新鲜培养基培养的HSC相比,移植能力几乎丢失.研究人员敏捷地意识到:他们培养体系中加入了酵母表达的重组人血清白蛋白(human serum albumin,HSA).他们认为HSA重组蛋白中可能存在的contaminants是引起培养过程中HSC干性丢失的罪魁祸首.于是,他们开始寻找HSA的替身.不负众望,从11种化学合成的candidates当中,作者找到了聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA).{在此之前有研究报道过PVA可替代serum albumin培养人类精子 {5} /小鼠胚胎 {6} /仓鼠胚胎 {7} }通过骨髓移植实验,作者发现PVA培养的HSC比HSA培养的HSC具有显著升高的移植能力;与他们假说一致,与HSA条件培养基相比,培养HSC持续14天的PVA条件培养基中炎症相关细胞因子和趋化因子显著降低,此表型能够被TLR4激动剂逆转. 研究人员还利用人类脐血HSC验证了PVA的扩增效果,同样发现与HSA相比,PVA显著促进脐血HSC的体外扩增.遗憾的是,此研究关于人类HSC的研究仅此一个实验.

最后研究人员确定了一个最适小鼠HSC体外培养条件:含有100 ng/mL TPO/10 ng/mL SCF/87% PVA/1% ITSX/10 mM HEPS/1% P/S/G的F12 medium.利用此培养体系,小鼠骨髓HSC体外培养28天后,骨髓移植极限稀释分析显示功能性HSC扩增可达236倍-899倍;同时,他们的结果显示小鼠HSC培养57天后仍然具有明显的血液重建能力. {值得注意的是,研究人员计算功能性HSC扩增倍数的时候提到:利用本次研究移植实验中的数据计算得到的扩增后功能性HSC数目除以之前发表过的论文所做移植实验中得到的新鲜分离细胞中功能性HSC数目} 由于优越的扩增效果,利用该体系扩增的HSC即使在不经过辐射的受体小鼠中也显示明显的植入能力.

HSC体外扩增对于拓展基于HSC移植的临床治疗意义重大.如果该研究属实,将是里程碑式的研究.领域内国内外同行对此研究高度关注,并在重复相关实验;尤其是该培养体系在人类HSC扩增中的适用性,因为本研究并未明确说明该培养方案能够长期扩增具有血液重建能力的人类功能性HSC.

参考文献

1. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H. & Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.  Science  273, 242-245 (1996).

2. Copelan, E. A. Hematopoietic stem-cell transplantation.  The New England journal of medicine  354, 1813-1826, doi: (2006).

3. Morrison, S. J. & Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.  Nature  505, 327-334, doi: (2014).

4. Kane, M. T. & Bavister, B. D. Protein-free culture medium containing polyvinylalcohol, vitamins, and amino acids supports development of eight-cell hamster embryos to hatching blastocysts.  The Journal of experimental zoology  247, 183-187, doi: (1988).

5.  M.H Javed, M Geisman, M.A Shaikh, C Ruberto, A.P Del Valle. Comparative Survival of Human Spermatozoa in Media Supplemented With Polyvinyl Alcohol or Human Serum Albumin. DOI: (00)01450-3

6. Biggers JD, Summers MC, McGinnis LK. Polyvinyl alcohol and amino acids as substitutes for bovine serum albumin in culture media for mouse preimplantation embryos. Hum Reprod Update . 1997 Mar-Apr;3(2):125-35.

7. Kane MT1, Bavister BD. Protein-free culture medium containing polyvinylalcohol, vitamins, and amino acids supports development of eight-cell hamster embryos to hatching blastocysts. J Exp Zool . 1988 Aug;247(2):183-7.

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