艾德思：Scienc新细菌如何绕过中心法则

2019年6月14日,美国普林斯顿大学 Mohamed S. Donia 教授 (共同一作为 昝金东 和 李志远 博士) 在 Science 杂志上发表论文 A microbial factory for defensive kahalalides in a tripartite marine symbiosis , 揭示海蛞蝓(kuò yú)和羽藻-黄杆菌共生体所构成的三方生态系统中,一种新细菌 Ca. E. kahalalidefaciens 以绕过中心法则和罕见的"多元化进化'提供化学防御.

海洋生态系统中,捕食和被捕食的对抗在庞大多层的食物网里广泛地进行着.在这无休无止的对抗中, 被捕食者们进化出了多种多样的化学手段进行防御 :比如,海藻往往自身合成毒素,而海绵常利用共生细菌的次级代谢产物吓阻捕食者,一些软体动物则从食物中获取化合物进行自我防御 {1} .对抗之外,合作和共生也在不同物种间广泛存在.有趣的是, 某些时候捕食者和被捕食者竟利用着相同的化合物进行防御 .例如,在这篇论文所研究的生态系统中,囊舌类软体动物海蛞蝓Elysia rufescens 利用名为 kahalalide F (KF) 的有毒多肽驱赶捕食它的鱼类,而海蛞蝓的食物,羽藻 Bryopsis sp ,也利用KF排斥一些海蛞蝓.

各种生物用于防御的次级代谢产物于捕食者是毒素,于人类而言却是药学上的宝藏.KF于上世纪九十年代在夏威夷檀香山的黑点海湾被发现,现已进入抑制多种癌症的二期临床试验 {2} .这篇工作围绕的中心问题便是 kahalalide F的起源 ——它是由羽藻合成的么?进化上,它从何而生,又由什么样的选择压力所塑造?

KF多肽的分子结构已经提示了它的特殊来源——它由13个氨基酸构成,其中7个氨基酸是D手性构型 (蛋白质中的氨基酸都是L构型) ,2个氨基酸是非蛋白源氨基酸 (nonproteinogenic) ;此外,它的头部是脂肪酸,且在尾部进行了环化 (下图) .这样的多肽很难由常规的"转录-翻译'中心法则合成,于是,本文的研究者们锁定了一类绕过中心法则的多肽合成通路: 非核糖体肽合成酶 ( Nonribosomal Peptide Synthetase,简称NRPS) {3} .

顾名思义,NRPS是一类独立于核糖体的/催化合成多肽链的蛋白酶.NRPS这种酶本身经中心法则转录翻译而成.然而, 从功能上,这个蛋白仿佛是一个核糖体+密码子+tRNA的"合体' .与中心法则迥异的是,它的"密码子'是直接"写'在自身的蛋白构象中的.具体来说, NRPS是一个模块化的"流水线',每个模块根据其特殊的三维构象挑选出特定的底物氨基酸,将其连在上一个模块制造好的多肽链上,然后传递给下一个模块 .n个模块构成的NRPS能生成包含n个氨基酸的多肽,并通过一些附加的蛋白域对多肽进行环化/差向异构化/羟基化等多种修饰.最重要的是,由于NRPS绕过了中心法则,它生成的多肽不受六十四个密码子并二十种氨基酸的限制,可以从超过五百种"非蛋白源' (nonproteinogenic) 的氨基酸底物中挑选肽链的组件.由此,NRPS的产物具有极高的多样性和可变性,特别适用于微生物相互竞争和对抗的"军备竞赛'.合成这类酶的基因簇普遍存在各种微生物中,合成了大量药学上有价值的代谢产物,例如抗生素/抗病毒/抗肿瘤药物等.

NRPS常见于细菌而非海藻,于是,KF很可能由海蛞蝓或者是羽藻的共生菌通过NRPS通路合成.为了验证"KF由细菌生成'这个假设,此工作的研究者数次前往夏威夷檀香山黑点海湾取样,将捕获的海藻和海蛞蝓于当地处理和保存后再寄回在美国东海岸的实验室进行后续分析:他们先利用Illumina 和 Pacbio 两种测序技术对样本的宏基因组进行测序,而利用实验室自己构建的NRPS数据库和组装程序, 对序列进行组装和分析. 经过多轮组装/比对和人工检查, 他们成功获取一个高质量的未被前人发现的黄杆菌科的细菌基因组 (下图) .

此工作中,研究者们通过多种方式检定了此细菌才是KF的真正来源.首先,该基因组中有一个70 kbps 的NRPS 基因簇,而利用各种基于NRPS基因序列的预测算法,研究者确了KF由该基因簇合成: 

1)该NRPS有13个模块,而 KF有13个氨基酸; 

2) KF有7个D-构象的氨基酸, 这和算法所预测的异构功能域的数量一致; 

3) 算法预测的每个模块的特异性和KF的实际序列相对应. 

其次, 根据16S rRNA 序列分析,此细菌也是这个藻菌群中含量最丰富的一种菌. 遗憾的是,研究者各种分离培养这种菌的尝试并未成功 .利用荧光原位杂交技术, 研究者进一步发现该菌寄生在羽藻的细胞之内,和羽藻形成共生关系. 于是,研究者们把这个菌命名为 Candidatus Endobryopsis Kahalalidefacien (简称cEK) .  cEK的基因组显著"缩水',总大小2.3 Mbps,仅为此科细菌平均值的一半,甚至很多重要功能性基因都已缺失, 比如它无法合成任何一种氨基酸. 这些特征和它胞内寄生菌的特性相吻合.

研究者进一步探究了海蛞蝓怎样获取KF —— 是和羽藻一样与cEK共生,还是直接从羽藻-cEK的共生体中通过捕食来摄入KF? 利用16S rRNA测序和对海蛞蝓的解剖及影像学分析, 研究者没有发现海蛞蝓体内存在 Ca. E. kahalalidefaciens 的证据.由此研究者阐明了这个 共生系统中KF的转移途径:  cEK是羽藻的"雇佣军',羽藻向其提供营养和保护,cEK则向羽藻提供包括KF在内的化学毒素. 然而,羽藻的捕食者之一海蛞蝓似乎进化出了对KF的部分抗性,可以将这些KF富集后用于驱赶捕食自己的鱼类.此外, 虽然海蛞蝓通过进食羽藻而积累KF,但cEK无法在海蛞蝓体内存活. 这种复杂的以防御分子为中心的细菌-食物-捕食者的共生系统可能在海洋中广泛存在.

合成KF 的基因簇并非 Ca. E. kahalalidefaciens 中唯一的NRPS.事实上,20个长短不一的NRPS基因簇占据了其20%的基因组总长度,这样高的基因组占比在其它细菌中前所未见.自从KF在1993年被分离出以来,多个研究组在同一地点的羽藻和海蛞蝓中分离出了十多种和KF类似的多肽,却无法确定这些多肽的来源.在这篇工作里,研究者通过质谱分析和生物信息学的对比分析发现,黑点海湾中至少还有８种多肽是也由cEK的这些NRPS基因簇合成.除了这9种已确定由cEK合成的多肽以外,cEK至少还有6个NRPS基因簇拥有完好的模块特征,可能在其它环境条件下合成多肽产物.此外,由于NRPS模块的特异性有时较低,而实验者之前发现的十多种多肽间很多只有一个氨基酸的差别,不排除黑点海湾所发现的所有多肽都由cEK合成的可能性.

有趣的是,虽然 Ca. E. kahalalidefaciens 制造的多肽拥有如此之高的多样性,受其只能在海藻细胞内生活的限制,cEK无法通过水平基因转移这一重要的多样性生成途径来获取新的NRPS片段.那么cEK的产物的化学多样性由何而来?通过生物信息学和计算生物学的方式,研究者详细分析了cEK这20个NRPS基因簇的进化轨迹,从而揭示了一个不同寻常的NRPS进化模型——根据前人的研究,大部分微生物中的NRPS遵循着"复制&分化' (duplication and divergence) 的模式,即NRPS基因簇或整段模块被复制后经由突变分化.然而,cEK中,20个基因簇以极高的频率进行基因片段的无差别重组—— 在尚未发表的数据中,研究者发现cEK的NRPS基因簇的重组频率比其它细菌高出至少一个数量级 .这些频繁的片段重组在大部分NRPS之间无差别地发生,甚至使得位于同一NRPS基因簇内的不同基因片段拥有了截然不同的系统树.这种名为" 多元化进化 ' (diversifying evolution) 的模式覆盖了基因簇"复制&分化'的进化轨迹,在没有水平基因转移的条件下促成了NRPS产物的化学多样性 (下图) .

总而言之, 一个只有很小的基因组的胞内寄生菌,丧失掉包括氨基酸合成在内的多种重要的功能, 却贡献了20%的基因组来合成十几种多肽——这种现象还从来没有被报道过. Ca. E. kahalalidefaciens 就好像羽藻的专属武器库, 专职负责生产用于防御的各种武器弹药;藻类提供衣食住行.这样分工明确又相互合作的关系,显示出长期共进化的潜能. 另外, 这也是第一次有报道显示大型海藻也可以如其它海洋无脊椎动物般利用共生菌来合成化学防御物质 .此外,cEK的多个NRPS基因簇以独特的"多元化进化'的方法获得内秉的化学多样性,也开启了NRPS进化分析的一扇新大门.

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