艾德思：王松灵基于CRISPRCas9系统创建致死基因敲除小鼠模型的新方法

 2019年6月,首都医科大学附属北京口腔医院/基础医学院王松灵教授团队在(5年IF:)上发表题为"Generating viable mice with heritable embryonically lethal mutations using the CRISPR/Cas9 system in two-cell embryos"的研究成果.该研究基于CRISPR/Cas9系统创建了二细胞胚胎一步显微注射法构建致死基因敲除小鼠模型的新方式,并申报国家发明专利.我校基础医学院/实验动物部仵毅博士与附属北京口腔医院张婧博士为共同第一作者,王松灵教授与基础医学院/实验动物部陈柏安副教授为共同通讯作者.

致死基因是指基因功能缺失导致个体在胚胎期和出生后死亡的一类基因,包括胚胎期致死基因和出生后致死基因.研究预测致死基因约占小鼠总基因的30%,因其在机体中发挥重要作用而备受关注.王松灵教授团队长期研究唾液腺功能,基于唾液腺发现人细胞膜上硝酸盐转运通道Sialin蛋白(由 Slc17a5 基因编码),但由于 Slc17a5 基因是出生后致死基因(敲除该基因的小鼠在出生后3周内即死亡),因此怎样构建成年期 Slc17a5 基因敲除小鼠模型成为研究该基因在成体内功能的关键技术瓶颈和难题.

基于Cre/Loxp重组系统的条件性基因敲除小鼠模型是研究致死基因成年机体内功能的现有方式,但该方式存在制作难度高/周期长(2年以上)等缺点,同时无法快速实现致死基因体内功能筛查,资源占用量大,不利于致死基因功能的研究.近几年发展起来的CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术,由于CRISPR/Cas9系统基因敲除效率高,传统的受精卵显微注射方法通常造成致死基因全身性敲除的首建鼠无法出生(胚胎期致死基因)或性成熟前死亡(出生后致死基因),因此运用CRISPR/Cas9系统通过受精卵注射方法亦无法构建可传代繁育的致死基因全身性敲除小鼠模型.针对上述两个传统技术的不足,王松灵教授团队探讨研发高效构建致死基因敲除小鼠模型的技术,形成基于CRISPR/Cas9系统将sgRNA和Cas9 mRNA或蛋白质在二细胞胚胎期一次注射至其中一个卵裂球的研究策略(见下图).王松灵教授团队利用该策略成功构建了 Slc17a5 出生后致死基因敲除嵌合小鼠,该小鼠可以携带致死基因突变并传代繁育,并发现Slc17a5基因敲除可致成年小鼠颌下腺组织内硝酸盐与唾液酸的转运明显低下.为了验证该策略的广谱适用性,该研究团队随机选取了另外一个出生后致死基因 Ctla4 和两个胚胎致死基因 Virma 及 Dpm1 ,利用该策略构建了这些基因的敲除嵌合小鼠,发现该类小鼠均可携带这些致死基因突变并传代繁育.利用本方式构建的小鼠可研究致死基因成年期的功能,如发现 Virma 基因敲除会导致成年小鼠局灶性节段性肾小球硬化; Ctla4 基因敲除可致小鼠成年期脾脏内Treg细胞增殖.

该研究创建的二细胞胚胎一步注射法既解决了传统CRISPR/Cas9系统方式无法构建全身性致死基因敲除小鼠的难题,又弥补了常规条件性基因敲除小鼠模型无法快速实现致死基因组织功能筛查的缺陷,从而为致死基因体内功能研究提供新的技术和思路.该研究的发表也标志着首都医科大学实验动物部在基因工程动物模型构建方面具有较好水平,能满足校内外众多领域关于致死性基因和常规基因敲除/基因编辑/脑重大疾病动物模型构建等动物实验技术需求.

本项目受到国家自然科学基金(91649124)和北京市政府基金北京学者项目(PXM2018_014226_000021)等基金资助.

王松灵,首都医科大学教授, 副校长,全国政协委员.中华口腔医学会副会长/北京医学会副会长/中国高等教育学会口腔医学教育学组组长.为< Oral Diseases >及< JOR >副主编,<中华口腔医学杂志>等6本期刊副主编.研究方向为唾液腺疾病诊治及基础研究/牙发育和再生研究.发表文章208篇,其中以通讯作者发表在< PNAS >< Blood >< Nature Communications >等英语文章117篇,英语review article 11篇.第一完成人获2003及2010年国家科技进步二等奖两项/2018年北京市科技进步一等奖;获国际牙科学会颁发的威廉盖茨(William J. Gies)奖/吴阶平医药创新奖/中源协和生命医学成就奖;入围Elsevier"中国高被引学者'榜,当选英国皇家外科学院(爱丁堡)杰出fellow.口腔医学界首位获国家杰出青年科学基金学者,入选首批北京学者.

陈柏安,首都医科大学基础医学院神经生物学系副教授,实验动物部副主任.主要从事脑重大疾病动物模型研制,认知功能障碍相关疾病的基础与转化研究.代表性研究文章在< Nature Methods >< Nature Communications >< Aging Cell >等杂志发表,相关研究成果分别被< New England Journal of Medicine >< The Lancet >< Science Translational Medicine >< Nature Protocol >等知名杂志文章引用.

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