贾宁博士揭示III型CRISPR系统抵御外源核酸的分子机制

CRISPR (clusteredregularly interspaced short palindromic repeats) - Cas (CRISPR-associated genes) 系统是多数细菌和绝大多数古细菌抵御外来核酸入侵的适应性免疫系统,该系统通过将外源短核酸片段整合到自身基因组中从而"记住'入侵过的外源核酸 {1} .自身基因组中含有外源核酸片段的基因随后经过转录和加工合成成熟的crRNA (CRISPR-derived RNAs) .crRNA 与Cas蛋白形成的复合物在crRNA引导下识别并且降解外源核酸片段.根据Cas蛋白的组分,CRISPR-Cas系统大体可以分为两类,Class 1 (包含 I, III,and IV亚型) 和Class 2 (包含 type II 和type V和type VI亚型) {2} .Class 1的 Cas 复合物由多种蛋白组成, Class 2 的Cas复合物仅含单个蛋白.

III-A CRIPSPR-Cas系统 (也被称为Csm 系统) 不仅可以在crRNA 的引导下特异性地降解靶RNA (RNA 酶活性) ,同时具有靶 RNA 依赖地降解单链DNA 的活性 (DNA酶活性) .2017年,Siksnys 和 Jinek 研究组同时鉴定了Csm系统具有环状腺苷 (cyclic oligoadenylates, cAn ) 合成酶活性 {3,4} .Csm 复合物结合靶RNA 后可以将单个ATP分子合成为cAn,合成的cAn 作为第二信使与下游的Csm6蛋白的CARF结构域结合从而激活Csm6的HEPN结构域的RNA 酶活性.因此,Csm是迄今已知的最为复杂的一类CRISPR-Cas系统,但是此前对于Csm 系统的三种酶活以及cAn怎样激活Csm6 RNA 酶活性的分子机理尚不清楚.

2018年11月29日, 纽约斯隆凯瑟琳癌症研究所的 DinshawPatel 课题组 ( 贾宁 博士为第一作者与共同通讯作者) 在 Molecular Cell 上发表了题为 Type III-A CRISPR-Cas Csm Complexes: Assembly,Periodic RNA Cleavage, DNase Activity Regulation, and Autoimmunity 的论文 ( Jia et al., 2019a) . 通过 Cryo-EM的手段解析了` Å Thermococcus onnurineus Csm 与crRNA 的二元复合物,以及与同源或非同源靶RNA的三元复合物的结构,从而为 Csm 复合物的组装,靶RNA的降解,靶RNA依赖的DNA 酶活性的调节以及自身免疫的调节机制提供了结构基础.此外,中国科学院生物物理研究所江涛/王祥喜合作团队,王艳丽/章新政合作团队以及哈尔滨工业大学的黄志伟团队也对Csm相关结构进行了报道 {5-7} .

虽然多个研究组解析了高分辨率的Csm复合物结构,但是对于Csm 复合物怎样将ATP 分子合成cAn以及cAn怎样激活其下游的Csm6 RNA酶活性的分子机制尚不清楚.

2019年7月17日, 纽约斯隆凯瑟琳癌症研究所的 Dinshaw Patel 课题组 ( 贾宁 博士为第一作者与共同通讯作者) 在 Molecular Cell 上同期背靠背发表了题为 Second Messenger cA4Formation within the Composite Csm1 Palm Pocket of Type III-A CRISPR Cas CsmComplex and Its Release Path ( Jia et al., 2019b) 和CRISPR-Cas III-A Csm6 CARF Domain Is a Ring Nuclease Triggering Stepwise cA4Cleavage with ApA>p Formation Terminating RNase Activity ( Jiaet al., 2019c ) 的两篇论文.

Jia et al., 2019b 论文通过Cryo-EM 和X-ray晶体学手段解析了 Å T. onnurineus Csm复合物与底物 (ATP) ,线性中间产物 (pppAn) 以及环化腺苷产物 (cAn) 的多个复合物结构, 从结构角度阐述了Csm 复合物将ATP分子合成为线性腺苷中间物然后环化成环状腺苷产物的过程,并且提出了合成后的环化腺苷的释放路径.

Jia et al., 2019c论文通过X-ray晶体学手段解析了下游效应蛋白T. onnurineusCsm6 与环状腺苷 (cA4) 的多种状态的复合物结构, 首次鉴定了 Csm6 不仅是一个环状腺苷激活的RNA酶,而且是一个环状腺苷降解酶, 并且详细阐述了第二信使分子 cA4怎样激活Csm6 RNA酶活,以及Csm6怎样降解cA4使得其RNA酶活关闭的分子机制.

III 型的CRISPR-Cas 系统具有特征性的Cas10蛋白,分为四个亚型 (III A-D) ,III-A 亚型 CRISPR-Cas复合物 (也称Csm 复合物) 由Csm1 (也被称为Cas10) , Csm2-5 共五个蛋白以及crRNA组成 (图1) .Csm6 虽然与Csm复合物蛋白在同一个阅读框中,但是并不与其直接相互作用,而是通过结合 cAn,激活自身的RNA酶活,从而降解单链RNA来抵御外来核酸侵害.

图1. III-A CRSPR-Cas 系统的基因簇图谱

研究人员首先通过生化实验证明Csm复合物可以将ATP分子合成为cAn,并证明其主要产物cA4为激活Csm6的效应分子,并且解析了 Å Csm 复合物与ATP底物类似物AMPPNP 的电镜结构, Å Csm 复合物与产物cA4的电镜结构 (图2) 以及Csm1-Csm4与一系列中间产物的晶体结构.通过结构分析表明,两个AMPPNP 分子结合在 Csm1的两个Palm 结构域之间,两个底物分子的结合具有协同效应,该结合模式使得 AMPPNP 分子 3'OH 可以亲核攻击另一个AMPPNP分子的a-磷酸基团,形成5′-3′磷酸二酯键从而产生中间线性产物pppApA (pppA2) .随后新的ATP分子不断加入,使其线性产物的长度不断增加产生 pppAn, 最终pppAn环化产生cAn,并且提出产物cAn的释放路径.

图二. Csm 与cA4复合物冷冻电镜结构

释放后的cAn 与下游Csm6的CARF 结构域结合,激活其HEPN结构域的RNA酶活性,但是cAn是怎样激活Csm6 RNA酶活性尚不清楚.此外,由于Csm6的RNA酶活性不能区别自我和非我的RNA,如果Csm6 一直处于激活状态,将对自身造成伤害,怎样关闭激活后的Csm6 的RNA酶活性仍然不清楚.2018年10月, White 研究组鉴定了一种环化腺苷降解酶可以降解 cA4,因此他们推测此 环化腺苷降解酶 可能在关闭Csm6的RNA酶活性中发挥重要作用 {8} .然而,此 环化腺苷降解酶 仅能降解游离的 cA 4,因此并不能关闭已经被cA4激活的Csm6 的RNA 酶活,并且,很多物种中并不存在这种环化腺苷降解酶.因此,激活后Csm6的RNA酶活性是怎样被关闭的这个问题仍然不清楚.

为了进一步探究这一系列的问题,研究人员解析了一系列的Csm6 及其突变体与其激活分子cA4的复合物结构.cA4 不仅可以作为激活分子结合于CARF结构域,同时也可以作为RNA底物结合于HEPN结构域,这也为研究人员对RNA底物结合以及降解机制的研究提供了便利条件.通过比对Csm6的活性状态与非活性状态,研究人员发现 cA4 与CARF 结构域的结合可以引起HEPN结构域所结合的RNA底物的结构变化,使得2'OH 与邻近的即将被切割的P-O5'的距离由 Å 变为 Å ,从而完成对RNA底物的切割 (图3) .值得注意的是,研究人员发现CARF结构域的 H132 A突变体可以不依赖于激活分子cA4而具有RNA 酶活,提示H132残基起到了自抑制自身RNA酶活的作用.此外,该研究组发现Csm6特异性地识别和切割A碱基,此前,张峰团队的SHERLOCKv2工具已将 Csm6与 Cas13联合用于RNA检测 {9} ,因此研究人员推测该Csm6 在RNA检测/编辑领域具有较高的潜在应用价值.

图三. Csm6非活性状态(E)和活性状态(F)的RNA结合模式

除此之外,令人意外的是,研究人员发现Csm6 CARF结构域不仅可以识别并结合cA4,同时也可以降解其激活分子cA4,随着激活分子cA4被CARF结构域降解成ApA>p (图4) ,其HEPN结构域的RNA 酶活性自动被关闭.该研究组首次鉴定Csm6不仅是一个环状腺苷激活的RNA降解酶,而且是一个环状腺苷降解酶,从而调节自身的RNA酶活,并不依赖额外的环状腺苷降解酶.

图四. Csm6 与cA4共结晶的晶体结构

该研究组系统性地阐述 III 型CRISPR系统抵御外源核酸的分子机制,详细阐述了该系统中靶RNA降解,靶RNA依赖的DNA降解,以及靶RNA 依赖的环化腺苷合成并激活下游的效应蛋白通路的分子机理,为基于III型CRISPR系统的应用工具的开发打下了重要的理论基础.

参考文献

1. Barrangou R, et al. (2007) CRISPR provides acquiredresistance against viruses in prokaryotes. Science 315(5819):1709-1712.

2. Koonin EV, Makarova KS, & Zhang F(2017) Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Current opinion in microbiology 37:67-78.

3. Kazlauskiene M, Kostiuk G, Venclovas C,Tamulaitis G, & Siksnys V (2017) A cyclic oligonucleotide signaling pathwayin type III CRISPR-Cas systems. Science 357(6351):605-609.

4. Niewoehner O, et al. (2017) Type III CRISPR-Cas systems produce cyclic oligoadenylatesecond messengers. Nature 548(7669):543-548.

5. Huo Y,et al. (2018) Cryo-EM structure of Type III-A CRISPR effector complex. Cell research 28(12):1195-1197.

6. You L,et al. (2019) Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanismof Co-tranional Interference. Cell 176(1-2):239-253 e216.

7. Guo M,et al. (2019) Coupling of ssRNA cleavage with DNase activity in type III-ACRISPR-Csm revealed by cryo-EM and biochemistry. Cell research.

8. Athukoralage JS, Rouillon C, Graham S,Gruschow S, & White MF (2018) Ring nucleases deactivate type III CRISPRribonucleases by degrading cyclic oligoadenylate. Nature 562(7726):277-280.

9. Gootenberg JS, et al. (2018) Multiplexed and portable nucleic acid detectionplatform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science 360(6387):439-444.

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