一份成功立项的省自然科学基金申报书

申请书正文

一.一般项目、重点项目和重大项目申请书正文报告撰写提纲

重要说明:

(1)要求分栏目舞写，条目清晰，标题突出。提纲的斜体字部分撰写后应删除

(2)正文旅告必须附主要参考文献目景，

(3) 报篇幅建议不超过 8000 字;

(4) 报告中不得透露申请者姓名、工作单位及相关信息

治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究

1.项目研究意义

类风湿性关节炎是一种发病率高、具有高度致残性、严重影响患者生活质量的自身免疫性疾病。如何有效治疗类风关、降低致我率、改善患者生活质量仍是当前中西医学界巫待攻破的难题之一。大量研究表明，细胞因子 TNF-和 L-在类风关发病中具有重要意义，研究和开发针对 TNF-a和 IL-1的抑制剂、筛选有效的治疗类风关的活性成分、寻找理想的治疗类风关药物或有效药物配合使用，始终是医药界的重大课题。

一、细胞因子 TF-a和L-1 在类风湿性关节炎发病和治疗中占有

重要位置

细胞因子是一组存在于细胞外的小分子多肚，是炎症、感染和免疫性疾病的重要介质它包括主要由单核巨噬细胞产生的炎性单核因子肿瘤坏死因子(TNF)、L-1IL6和L-8等，以及由淋巴细胞产生的 L-2、IL-4、IL-L-9IL-10 和N等。已知单核因子在类风湿性关节炎(RheumatoidArthritisRA)的急性滑膜炎症，滑膜纤维化，骨和软骨破坏中起重要作用。其中IL-1(尤其是L-1B)和 TNF-a在 RA 发病机制及治疗中起主导地位。

TNF-和IL-1(尤其是I-B)在 RA 发病机制中起主导地位。TNF-a IL-1均由单核巨噬细胞产生，许多研究证实 RA思者外周血单核细胞(PBMC)和关节滑膜液的巨噬细胞(SFMC)能分泌 IL-1和 TNF-，使外周血和关节滑液IL-1、TNF-a增高。1987 年Danis 等用生物学方法测定 RA的PBMC和SFMC分的L-1，均较正常对照和 RA组

申请书正文

一.一般项目、重点项目和重大项目申请书正文报告撰写提纲

重要说明:

(1)要求分栏目舞写，条目清晰，标题突出。提纲的斜体字部分撰写后应删除

(2)正文旅告必须附主要参考文献目景，

(3) 报篇幅建议不超过 8000 字;

(4) 报告中不得透露申请者姓名、工作单位及相关信息

治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究

1.项目研究意义

类风湿性关节炎是一种发病率高、具有高度致残性、严重影响患者生活质量的自身免疫性疾病。如何有效治疗类风关、降低致我率、改善患者生活质量仍是当前中西医学界巫待攻破的难题之一。大量研究表明，细胞因子 TNF-和 L-在类风关发病中具有重要意义，研究和开发针对 TNF-a和 IL-1的抑制剂、筛选有效的治疗类风关的活性成分、寻找理想的治疗类风关药物或有效药物配合使用，始终是医药界的重大课题。

一、细胞因子 TF-a和L-1 在类风湿性关节炎发病和治疗中占有

重要位置

细胞因子是一组存在于细胞外的小分子多肚，是炎症、感染和免疫性疾病的重要介质它包括主要由单核巨噬细胞产生的炎性单核因子肿瘤坏死因子(TNF)、L-1IL6和L-8等，以及由淋巴细胞产生的 L-2、IL-4、IL-L-9IL-10 和N等。已知单核因子在类风湿性关节炎(RheumatoidArthritisRA)的急性滑膜炎症，滑膜纤维化，骨和软骨破坏中起重要作用。其中IL-1(尤其是L-1B)和 TNF-a在 RA 发病机制及治疗中起主导地位。

TNF-和IL-1(尤其是I-B)在 RA 发病机制中起主导地位。TNF-a IL-1均由单核巨噬细胞产生，许多研究证实 RA思者外周血单核细胞(PBMC)和关节滑膜液的巨噬细胞(SFMC)能分泌 IL-1和 TNF-，使外周血和关节滑液IL-1、TNF-a增高。1987 年Danis 等用生物学方法测定 RA的PBMC和SFMC分的L-1，均较正常对照和 RA组明显增多。1988年Nobuywki测定滑膜培养上清液中IL-1活性这种活性只存在于RA的滑膜中而不存在于非 RA滑膜，且 RA滑膜中L-1的增高与关节镜下炎症所见、与免疫组化所测得 HLA-DR 表现、与X线关节破坏有较好的一致性。目前较一致的认识是 TNF-a与L-1主要参与:(1)激活血管内皮细胞、增加内皮细胞粘附分子表达、使中性粒细胞在滑膜腔内集聚，(2)刺激滑膜细胞和中性粒细胞产生前列腺素等炎性介质，(3)刺激软骨细胞和破骨细胞减少蛋白合成、增加糖蛋白降解，并产生胶原酶及其他中性蛋白酸类，释放骨钙等，从而导致 RA滑膜、软骨与软骨下骨的破坏，并与 RA的发热、贫血、急性期反应蛋白合成等密切相关，因而，TNF-a与 IL-1在RA 发病机制中起主导地位。

TNF-a与L-1是RA的有效治疗目标。TNF-a成为有效的 RA治疗目标的证据主要有三个方面:(1)类风湿性滑膜细胞离体培养试验中，加入抗 TNFa抗体(抗-TNFa)能使培养物中IL-1的生物活性降低，后来发现滑膜中 GM-CSF、I-6、IL-8 水平也降低，表明 TNFa阻断能使其他促炎因子的生成减少，(2)用抗体或TNF 受体(TNFR)Fe融合蛋白来抑制TNF-4，对I型胶原诱导的关节炎模型动物有明显益处，即使在疾病发作后再开始治疗多数情况下效果也很显著，(3)免疫组织学方法证实，受LPS刺激后，新冷冻组织中 TNE及其受体的表达上调,说明TNF与其受体间的相五作用在体内非常重要，进一步表明TNFa可能是很好的 RA治疗目标。IL-1 则对关节软骨损伤有更密切的关系。曾经有人认为阻断IL-1对控制关节损伤至关重要，因为体内外试验发现IL-1比TNFA更容易引起软骨和骨损伤。L-1 对炎性部位的持续性细胞浸润和诱导组织破坏起着更直接的作用，是骨质吸收和骨质破坏的主要细胞因子之一。这一结论目前已广为接受。此外，TNF-和 IL-1在许多系统中具有协同作用，有研究表明，一方面 IL-1产生过多必促进 TNF-a产生过多，另一方面TNFa减少不仅会减少关节内的 L-1生成，而且会减轻TNFA和 L-1 的协同效应。在体外向RA滑膜细胞添加抗-TNFa可减少IL-1的合成，在抗类风关新药 fiximab、D2E7的体内试验中亦可得到同样的证据。

加强对治疗类风关中药有效成分整合的研究是提高类风关治疗效果的希望所在

类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病，传统抗炎药物疗效有限，难以治愈是当今医学研究领域的热点之一。因此，筛选有效的治疗RA活性成分、寻找理想的治疗RA药物或有效药物配合使用，始终是医药界的重大课题。

毋用否认，中医药治疗类风湿性关节炎有悠久的历史，具有良好而确实的疗效，在群众中享有较高的信誉。近几十年来，中医药在治疗类风关方面进行了深入的研究，对类风关确有疗效的一批有效中药成分已被研究清楚，如雷公藤多武、祖师麻甲素、汉防己甲素乌头生物碱、青枫藤碱、白芍总武等，而且一部分已被制成新的制剂、作为新药在临床上使用，并取得了一定成效。但总体而言，与现代医学治疗效果近似，中医药的疗效仍不能较完满地满足类风关治疗的需要，即使是目前在临床上应用最广泛、公认为疗效最显著的雷公藤多武，综合各家文献报道，其临床治疗显效率亦仅 50%左右，且存在性脉抑制、血液系统、肝功能损害等副作用，因此尚期待中医药治疗有进一步突破性提高。

由于类风关病情复杂多变，目前现代医学认为任何一种药物都不能阻止其对骨质的破坏，对其治疗采用联合用药可以提高疗效。滑膜组织的过度增生和免疫细胞的功能紊乱是积极联合治疗的理论基础，当今医学大量研究结果显示，单用甲氨媒岭不能认为是治疗RA的金标准，即使在早期积极使用甲氨媒吟，其单独使用的临床效果也无法与联合治疗效果相比。对甲氨媒吟单一给药与联合给药治疗早期 RA患者的结果进行比较，除X线进展在两种药物联合治疗组与三种药物联合治疗组未显示差异有显著性外，其余结果均显示差异有显著性，提示联合治疗优于单一用药。另外，联合治疗往往可以避免单一药物治疗过程中常常发生药物抵抗现象，如研究显示环跑素和轻氯隆联合使用可以竞争性地抑制耐药基因以及基因产物的产生，从而在药代动力学方面阐述了联合治疗效果优于单一药物的机制。多数学者在治疗类风关临床实践中，认识到早期积极给予联合治疗，即所谓的“下台阶”治疗策略可以明显提高疗效。总之，联合治疗是 RA 治疗的一个亮点，其精髓是利用药物的不同药理作用或作用部位以增加疗效，或分别用较小剂量以减少副作用，希望通过联合用药以诱导缓解，然后逐渐减少药物的种类和药物剂量，最后选取副作用较少而有效的药物长期维持。

借鉴现代医学的研究方法、结果，我们认为寄希望于开发出卓有成效的中药新的有效成分和制剂可能是一种奢望，提高中医药治疗类风关疗效的关键，在目前来看可能在于如何有效地将中药抗风湿有效成分进行有效整合。就象著名的艾滋病治疗的“鸡尾酒疗法”样，将目前治疗类风关有效的几种或更多中药有效成分加以整合，通过整合提高疗效，通过整合出新效果。具体而言有三，1.类风关的中西医结合研究已经历漫长道路，药物研究不断深入，单一的药物有效成分正不断被发现、提取，而这确实能够提高治疗疗效，2.现代医学已从单一药物治疗向联合用药治疗发展。认为单一用药易于产生耐药性，药物作用靶点单一，往往副作用明显，而联合用药并不一定增加药物副作用，而且药物作用靶点丰富、不易产生耐药性。依照如此思路，我们认为有必要按照中医学方剂的配伍原则，对相关中药有效成分进行进一步整合，以提高临床治疗效果。3.治疗类风湿关节炎有效的中药成分较西药有一定的优势，如副作用较小，复方药物有多层次、多靶点疗效等特点。若能吸取前人治疗经验，并应用科学研究方法把从中筛选出的对滑膜细胞有抑制作用的有效药物成分进一步整合，则对类风湿关节炎的治疗将会起到巨大的推动作用。4.由于中药作用的特殊性，较之西药的二、三联用药，中药可能需要更多的有效成分组合使用，并按照中药方剂的君、臣、佐、使原则配伍，方能达到较理想的目的。

总之，TNF-a和 L-1是类风湿性关节炎发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子，针对IL-1和 TNF-及其抑制剂的新疗法研究目前仍处于摸索阶段。探索整合治疗类风关中药有效成分以提高类风关治疗效果，以及对类风湿性关节炎鼠细胞因子 TNF 和1关系研究尚少报道，本课题希望能从这一方面进行一些探索，若能向前前进一步，将有助于类风关治疗效果的提高。

项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系;

本项目研究目标:明确在类风关中局部组织中TNF-a和IL-1对关节的破坏可能居于更重要作用，有效中药成分组方对大鼠佐剂性关节炎模型中血清及滑膜细胞培养上清液中细胞因子TNF-a和IL-1的作用及不同剂量中药成分组方治疗类风关模型鼠的最佳配伍方案。本课题申请者长期致力于风湿性疾病的基础和临床研究，该课题是有关于治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究，是申请者长期研究工作中的一个主要子课题。

3、项目研究内容，研究方案和进度安排

1.实验材料

1.1动物选择:选择 Wstar 大鼠，雌性，6~8周龄，170~200g，清洁级，由浙江中医学院实验动物中心提供。

1.2主要试药 不完全弗氏佐剂，Sigma 公司。冻干注射用灭毒卡介苗(BCG)，50mg瓶上海生物制品研究所。小牛血清:美国 Hyclone公司，临床用前56C，30min灭活补体活性。完全培养液:低糖 DMEW 培养粉，Hyclone公司。加入25mmol/L Hpes，molL丙酮钠,20mmol/L L-谷氨胺,50mmol/L 二硫基醇青霉钠 100KUL,硫酸霉素 100mgL;并按说明书要求,加入碳酸氢钠 3.7gL。使用时加入小牛血清,浓度为 15%,最后以1mol/L碳酸氢钠调节至pH7.2~7.4。

中药有效成分乌头碱、青藤碱、马钱子诚、商陆皂武、山莱英多武、汉防己甲素、祖师麻甲素市售或浙江中医学院中药系提供。雷公藤多武片，市售。

检测试剂盒:TN Fa、I L-1、INF检测试剂盒，均购自北京邦定生物医学公司。1.3主要仪器 体积测量仪(自制);McromSeriesSA-300V高压灭菌器，KS-250超声波细胞粉碎仪，超静工作台，SW-GJ-1F 型，苏州安泰空气技术有限公司产品，CO衡温培养箱，HWO301T-VBA型，美国HARRIS 公司产品;常温低速离心机，LDFZ4-OB型，上海医用离心机厂;倒置相差显微镜,DMIRB型德国LEICA公司产品;计数仪BECKHANDP5500型，-80度低温冰箱

2.实验方法

2.1 大鼠佐剂性关节炎模型的建立

RA 的动物模型有多种，弗氏完全佐剂(FCA)诱导的大鼠佐剂性关节炎(AdjuvantArthritisAA)是最为经典、最为常用的RA实验模型。弗氏完全佐剂是一种在弗氏不完全佐剂(FIA)基础上，加入灭活卡介苗溶液(BCG制成 W/O 乳剂，采取皮内注射，目的是为延缓机体对 BCG的吸收，造成 BCG对机体的不断刺激而产生继发的自身免疫应答反应。其原理为 BCG作为抗原进入机体使T细胞致敏(称急性炎症反应)，当再次接触抗原，致敏T细胞分化增殖，释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞，引起单核细胞浸润同时由抗原抗体形成的免疫复合物激活补体，导致白细胞趋化激活，释放一系列致炎因子产生局部和全身性炎症反应(称继发反应)。我们通过改良后《增加佐剂浓度)解决了这一模型在县体操作中存在的造模成功率低、病变程度个体养异大等一系列问题。

2.1.1弗氏完全佐剂的的制备

212A

原发病变属急性应激反应，表现为致炎侧的关节、足距红肿，致敏后即可出现，18~24h 达峰值，持续5d 后逐渐减轻，继发病变属自身免疫应答反应，表现为造模 8~9d后再度出现的致炎侧、非致炎侧(对侧)及双前肢的关节和足蹈肿胀，耳、尾“关节炎”结节，变应性角膜翳以及体重下降等。

具体操作步骤:对所选择雌性 90只 Wistar 大鼠，第一天于左后脚底区注射0.1mI完

申请书正文

一.一般项目、重点项目和重大项目申请书正文报告撰写提纲

重要说明:

(1)要求分栏目舞写，条目清晰，标题突出。提纲的斜体字部分撰写后应删除

(2)正文旅告必须附主要参考文献目景，

(3) 报篇幅建议不超过 8000 字;

(4) 报告中不得透露申请者姓名、工作单位及相关信息

治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究

1.项目研究意义

类风湿性关节炎是一种发病率高、具有高度致残性、严重影响患者生活质量的自身免疫性疾病。如何有效治疗类风关、降低致我率、改善患者生活质量仍是当前中西医学界巫待攻破的难题之一。大量研究表明，细胞因子 TNF-和 L-在类风关发病中具有重要意义，研究和开发针对 TNF-a和 IL-1的抑制剂、筛选有效的治疗类风关的活性成分、寻找理想的治疗类风关药物或有效药物配合使用，始终是医药界的重大课题。

一、细胞因子 TF-a和L-1 在类风湿性关节炎发病和治疗中占有

重要位置

细胞因子是一组存在于细胞外的小分子多肚，是炎症、感染和免疫性疾病的重要介质它包括主要由单核巨噬细胞产生的炎性单核因子肿瘤坏死因子(TNF)、L-1IL6和L-8等，以及由淋巴细胞产生的 L-2、IL-4、IL-L-9IL-10 和N等。已知单核因子在类风湿性关节炎(RheumatoidArthritisRA)的急性滑膜炎症，滑膜纤维化，骨和软骨破坏中起重要作用。其中IL-1(尤其是L-1B)和 TNF-a在 RA 发病机制及治疗中起主导地位。

TNF-和IL-1(尤其是I-B)在 RA 发病机制中起主导地位。TNF-a IL-1均由单核巨噬细胞产生，许多研究证实 RA思者外周血单核细胞(PBMC)和关节滑膜液的巨噬细胞(SFMC)能分泌 IL-1和 TNF-，使外周血和关节滑液IL-1、TNF-a增高。1987 年Danis 等用生物学方法测定 RA的PBMC和SFMC分的L-1，均较正常对照和 RA组明显增多。1988年Nobuywki测定滑膜培养上清液中IL-1活性这种活性只存在于RA的滑膜中而不存在于非 RA滑膜，且 RA滑膜中L-1的增高与关节镜下炎症所见、与免疫组化所测得 HLA-DR 表现、与X线关节破坏有较好的一致性。目前较一致的认识是 TNF-a与L-1主要参与:(1)激活血管内皮细胞、增加内皮细胞粘附分子表达、使中性粒细胞在滑膜腔内集聚，(2)刺激滑膜细胞和中性粒细胞产生前列腺素等炎性介质，(3)刺激软骨细胞和破骨细胞减少蛋白合成、增加糖蛋白降解，并产生胶原酶及其他中性蛋白酸类，释放骨钙等，从而导致 RA滑膜、软骨与软骨下骨的破坏，并与 RA的发热、贫血、急性期反应蛋白合成等密切相关，因而，TNF-a与 IL-1在RA 发病机制中起主导地位。

TNF-a与L-1是RA的有效治疗目标。TNF-a成为有效的 RA治疗目标的证据主要有三个方面:(1)类风湿性滑膜细胞离体培养试验中，加入抗 TNFa抗体(抗-TNFa)能使培养物中IL-1的生物活性降低，后来发现滑膜中 GM-CSF、I-6、IL-8 水平也降低，表明 TNFa阻断能使其他促炎因子的生成减少，(2)用抗体或TNF 受体(TNFR)Fe融合蛋白来抑制TNF-4，对I型胶原诱导的关节炎模型动物有明显益处，即使在疾病发作后再开始治疗多数情况下效果也很显著，(3)免疫组织学方法证实，受LPS刺激后，新冷冻组织中 TNE及其受体的表达上调,说明TNF与其受体间的相五作用在体内非常重要，进一步表明TNFa可能是很好的 RA治疗目标。IL-1 则对关节软骨损伤有更密切的关系。曾经有人认为阻断IL-1对控制关节损伤至关重要，因为体内外试验发现IL-1比TNFA更容易引起软骨和骨损伤。L-1 对炎性部位的持续性细胞浸润和诱导组织破坏起着更直接的作用，是骨质吸收和骨质破坏的主要细胞因子之一。这一结论目前已广为接受。此外，TNF-和 IL-1在许多系统中具有协同作用，有研究表明，一方面 IL-1产生过多必促进 TNF-a产生过多，另一方面TNFa减少不仅会减少关节内的 L-1生成，而且会减轻TNFA和 L-1 的协同效应。在体外向RA滑膜细胞添加抗-TNFa可减少IL-1的合成，在抗类风关新药 fiximab、D2E7的体内试验中亦可得到同样的证据。

加强对治疗类风关中药有效成分整合的研究是提高类风关治疗效果的希望所在

类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病，传统抗炎药物疗效有限，难以治愈是当今医学研究领域的热点之一。因此，筛选有效的治疗RA活性成分、寻找理想的治疗RA药物或有效药物配合使用，始终是医药界的重大课题。

毋用否认，中医药治疗类风湿性关节炎有悠久的历史，具有良好而确实的疗效，在群众中享有较高的信誉。近几十年来，中医药在治疗类风关方面进行了深入的研究，对类风关确有疗效的一批有效中药成分已被研究清楚，如雷公藤多武、祖师麻甲素、汉防己甲素乌头生物碱、青枫藤碱、白芍总武等，而且一部分已被制成新的制剂、作为新药在临床上使用，并取得了一定成效。但总体而言，与现代医学治疗效果近似，中医药的疗效仍不能较完满地满足类风关治疗的需要，即使是目前在临床上应用最广泛、公认为疗效最显著的雷公藤多武，综合各家文献报道，其临床治疗显效率亦仅 50%左右，且存在性脉抑制、血液系统、肝功能损害等副作用，因此尚期待中医药治疗有进一步突破性提高。

由于类风关病情复杂多变，目前现代医学认为任何一种药物都不能阻止其对骨质的破坏，对其治疗采用联合用药可以提高疗效。滑膜组织的过度增生和免疫细胞的功能紊乱是积极联合治疗的理论基础，当今医学大量研究结果显示，单用甲氨媒岭不能认为是治疗RA的金标准，即使在早期积极使用甲氨媒吟，其单独使用的临床效果也无法与联合治疗效果相比。对甲氨媒吟单一给药与联合给药治疗早期 RA患者的结果进行比较，除X线进展在两种药物联合治疗组与三种药物联合治疗组未显示差异有显著性外，其余结果均显示差异有显著性，提示联合治疗优于单一用药。另外，联合治疗往往可以避免单一药物治疗过程中常常发生药物抵抗现象，如研究显示环跑素和轻氯隆联合使用可以竞争性地抑制耐药基因以及基因产物的产生，从而在药代动力学方面阐述了联合治疗效果优于单一药物的机制。多数学者在治疗类风关临床实践中，认识到早期积极给予联合治疗，即所谓的“下台阶”治疗策略可以明显提高疗效。总之，联合治疗是 RA 治疗的一个亮点，其精髓是利用药物的不同药理作用或作用部位以增加疗效，或分别用较小剂量以减少副作用，希望通过联合用药以诱导缓解，然后逐渐减少药物的种类和药物剂量，最后选取副作用较少而有效的药物长期维持。

借鉴现代医学的研究方法、结果，我们认为寄希望于开发出卓有成效的中药新的有效成分和制剂可能是一种奢望，提高中医药治疗类风关疗效的关键，在目前来看可能在于如何有效地将中药抗风湿有效成分进行有效整合。就象著名的艾滋病治疗的“鸡尾酒疗法”样，将目前治疗类风关有效的几种或更多中药有效成分加以整合，通过整合提高疗效，通过整合出新效果。具体而言有三，1.类风关的中西医结合研究已经历漫长道路，药物研究不断深入，单一的药物有效成分正不断被发现、提取，而这确实能够提高治疗疗效，2.现代医学已从单一药物治疗向联合用药治疗发展。认为单一用药易于产生耐药性，药物作用靶点单一，往往副作用明显，而联合用药并不一定增加药物副作用，而且药物作用靶点丰富、不易产生耐药性。依照如此思路，我们认为有必要按照中医学方剂的配伍原则，对相关中药有效成分进行进一步整合，以提高临床治疗效果。3.治疗类风湿关节炎有效的中药成分较西药有一定的优势，如副作用较小，复方药物有多层次、多靶点疗效等特点。若能吸取前人治疗经验，并应用科学研究方法把从中筛选出的对滑膜细胞有抑制作用的有效药物成分进一步整合，则对类风湿关节炎的治疗将会起到巨大的推动作用。4.由于中药作用的特殊性，较之西药的二、三联用药，中药可能需要更多的有效成分组合使用，并按照中药方剂的君、臣、佐、使原则配伍，方能达到较理想的目的。

总之，TNF-a和 L-1是类风湿性关节炎发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子，针对IL-1和 TNF-及其抑制剂的新疗法研究目前仍处于摸索阶段。探索整合治疗类风关中药有效成分以提高类风关治疗效果，以及对类风湿性关节炎鼠细胞因子 TNF 和1关系研究尚少报道，本课题希望能从这一方面进行一些探索，若能向前前进一步，将有助于类风关治疗效果的提高。

项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系;

本项目研究目标:明确在类风关中局部组织中TNF-a和IL-1对关节的破坏可能居于更重要作用，有效中药成分组方对大鼠佐剂性关节炎模型中血清及滑膜细胞培养上清液中细胞因子TNF-a和IL-1的作用及不同剂量中药成分组方治疗类风关模型鼠的最佳配伍方案。本课题申请者长期致力于风湿性疾病的基础和临床研究，该课题是有关于治疗类风关中药有效成分整合及对模型鼠细胞因子作用的研究，是申请者长期研究工作中的一个主要子课题。

3、项目研究内容，研究方案和进度安排

1.实验材料

1.1动物选择:选择 Wstar 大鼠，雌性，6~8周龄，170~200g，清洁级，由浙江中医学院实验动物中心提供。

1.2主要试药 不完全弗氏佐剂，Sigma 公司。冻干注射用灭毒卡介苗(BCG)，50mg瓶上海生物制品研究所。小牛血清:美国 Hyclone公司，临床用前56C，30min灭活补体活性。完全培养液:低糖 DMEW 培养粉，Hyclone公司。加入25mmol/L Hpes，molL丙酮钠,20mmol/L L-谷氨胺,50mmol/L 二硫基醇青霉钠 100KUL,硫酸霉素 100mgL;并按说明书要求,加入碳酸氢钠 3.7gL。使用时加入小牛血清,浓度为 15%,最后以1mol/L碳酸氢钠调节至pH7.2~7.4。

中药有效成分乌头碱、青藤碱、马钱子诚、商陆皂武、山莱英多武、汉防己甲素、祖师麻甲素市售或浙江中医学院中药系提供。雷公藤多武片，市售。

检测试剂盒:TN Fa、I L-1、INF检测试剂盒，均购自北京邦定生物医学公司。1.3主要仪器 体积测量仪(自制);McromSeriesSA-300V高压灭菌器，KS-250超声波细胞粉碎仪，超静工作台，SW-GJ-1F 型，苏州安泰空气技术有限公司产品，CO衡温培养箱，HWO301T-VBA型，美国HARRIS 公司产品;常温低速离心机，LDFZ4-OB型，上海医用离心机厂;倒置相差显微镜,DMIRB型德国LEICA公司产品;计数仪BECKHANDP5500型，-80度低温冰箱

2.实验方法

2.1 大鼠佐剂性关节炎模型的建立

RA 的动物模型有多种，弗氏完全佐剂(FCA)诱导的大鼠佐剂性关节炎(AdjuvantArthritisAA)是最为经典、最为常用的RA实验模型。弗氏完全佐剂是一种在弗氏不完全佐剂(FIA)基础上，加入灭活卡介苗溶液(BCG制成 W/O 乳剂，采取皮内注射，目的是为延缓机体对 BCG的吸收，造成 BCG对机体的不断刺激而产生继发的自身免疫应答反应。其原理为 BCG作为抗原进入机体使T细胞致敏(称急性炎症反应)，当再次接触抗原，致敏T细胞分化增殖，释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞，引起单核细胞浸润同时由抗原抗体形成的免疫复合物激活补体，导致白细胞趋化激活，释放一系列致炎因子产生局部和全身性炎症反应(称继发反应)。我们通过改良后《增加佐剂浓度)解决了这一模型在县体操作中存在的造模成功率低、病变程度个体养异大等一系列问题。