【国自然热点】可变剪接的课题设计思路是什么样的？

　【国自然热点】可变剪接的课题设计思路是什么样的？今天为大家分享关于基因调控机制之可变剪接的课题设计思路，希望大家在学习了今天的课程内容后，都能有所收获。我们将从“可变剪接”的概念、相关案例分析和研究思路这几个方面展开，干货满满!快来边听课边学习吧~

　　概述

　　可变剪接：可变剪接(Alternative splicing)也叫选择性剪接，是指在mRNA前体到成熟mRNA的过程当中，不同的剪切方式所产生的外显子以多种方式进行重连，使得同一个基因可以产生多个不同的成熟mRNA，最终产生具有不同甚至相反功能蛋白质的过程。

　　生物学意义：通过可变剪接，可以产生多种蛋白产物，放大了不同物种基因组的差别，极大地丰富了不同物种的多样性。可变剪接与生物体的健康息息相关，其突变可能导致疾病。

　　可变剪接由剪接体(spliceosome)催化完成。剪接体主要是由核小RNA(snRNA，包括U1、U2、U4、U5、U6等)和蛋白质因子(约100多种)动态组成的核糖核蛋白复合体。

　　根据剪接调控元件的不同，可变剪接可分为5种模式：

　　外显子跳过：外显子被“跳过”，不包含在 mRNA 中

　　外显子互斥：只有一个单一的外显子在多个相邻的外显子中被保留在成熟的mRNA 中

　　5’端竞争性剪接：替代上游外显子3’端的剪接位点

　　3’端竞争性剪接：替代下游外显子5’端的剪接位点

　　5’内含子不切割：内含子区域保留在成熟的mRNA 中

　　可变剪接的调节因子包括：多嘧啶结合蛋白1(PTBP1)、平衡性核苷转运体1(SLC29A1)、一些异源核蛋白(hnRNPs)和非编码RNA(microRNAs、lncRNAs、circRNAs、snRNAs)等。

　　另外，异常的可变剪接与多种疾病相关，包括前列腺癌、肝癌、非酒精性脂肪肝病、阿尔茨海默病、心血管疾病、自身免疫性疾病等。

　　PTBP1：在癌症中，主要作为糖酵解、凋亡、增殖、生瘤、侵袭和迁移的调节因子

　　相信通过以上内容的介绍，大家对可变剪接一定也有了更多了解~那么接下来，我们将通过案例分析，来帮助大家更直观地了解“可变剪接”的研究过程。

　　案例分析

　　这是一篇名为《NEMO遗传程序性可变剪接介导自身炎症性疾病表型》的高分文献，发表于The Journal of Clinical Investigation，影响因子为15.9。下面，我们来了解一下这篇论文的研究背景。

　　自身免疫性疾病：指人体免疫系统错误地攻击自身组织或器官，导致炎症、组织损伤和功能障碍的一系列疾病。严重的自身免疫性疾病可导致器官损伤和功能障碍，影响器官的正常功能，并增加患者感染风险。

　　NEMO：NF-κB必需调节因子，是一种具有广泛免疫细胞和组织表达谱的支架蛋白。编码NEMO基因的C端缺失突变，通常会导致自身炎症综合征及免疫缺陷。但NEMO如何与细胞中的IKK相关激酶结合以维持炎症和免疫的平衡，目前尚不清楚。

　　因此，为了研究NEMO如何与细胞中的IKK相关激酶结合以维持炎症和免疫的平衡，作者进行了相关实验研究。

　　Fig1

　　一种替代性NEMO亚型的表达会导致严重的自身炎症性疾病

　　首先，作者明确了患者(P1、P2和P3)没有类似自身免疫疾病的家族病史(图A)，然后通过Sanger测序发现患者DNA外显子5的内含子的剪接调控结构域，发生了2次新的单核苷酸变化(图B)。接着，作者观察到在患者P1、P2和P3的外显子5上，均缺失153个核苷酸。此外，来自患者P1的长cDNA变体的序列分析则证实了同义外显子5的c.597G>A突变(图C)。

　　图B中IKBKG是编码NEMO蛋白的基因

　　然后，作者构建了一个包含IKBKG外显子4-6的微基因。并且发现，用该微基因转染会产生大量全长转录物(FL-NEMO)，但用含有来自患者P1、P2和P3的突变序列的微基因转染则会导致缩短转录物变体(NEMO-Δex5)的数量增加(图D)。

　　FL-NEMO，是未突变的NEMO蛋白亚型

　　NEMO-Δex5，是缺乏外显子5的NEMO蛋白亚型

　　另外，在患者P1的成纤维细胞中，作者观察到低水平的FL-NEMO蛋白表达和高水平的NEMO-Δex5，其中患者P2和P3的细胞具有较低水平的NEMO-Δex5和较高水平的FL-NEMO(图E);但在对照细胞中却检测不到NEMO-Δex5(图F)。

　　通过以上实验验证后，作者最终得出结论：一种替代性NEMO亚型(NEMO-Aex5亚型)的表达会导致严重的自身炎症性疾病。

　　Fig2

　　NEMO-Δex5阻断poly(I:C)对NF-κB的激活，但未影响TNF诱导的NF-κB

　　接着，作者开始探究可变剪接对靶蛋白的功能影响，并为此进行了更多深入性的实验研究。

　　作者通过实验发现，外显子5编码的结构域可以介导NEMO与TANK的相互作用，并与TBK1形成三元复合物(图A);而转染NEMO-Δex5后，则检测到NEMO与TANK和TBK1的结合力被降低(图B)。此外，作者还观察到，在患者P1的细胞中，poly(I:C)诱导的NF-κB激活受损最严重(图C);TNF(肿瘤坏死因子)可以正常诱导IκBα降解和p65磷酸化(图D)。

　　在P1成纤维细胞中，作者发现NF-κB的亚基p65的核转位对TNF诱导的反应是正常的，但对poly(I:C)的反应缺失(图E)。另外，我们可以看到NEMO-△ex5的过表达，减少了对照细胞中poly(I:C)诱导的NF-κB活化。相反，FL-NEMO的表达逆转了患者P1的成纤维细胞中NF-κB活化抑制(图F)。

　　NF-κB活化，表现为NF-κB的亚基p65的核转位

　　从实验结果中，我们还可以看到，TNF诱导的P1成纤维细胞中的基因表达是完整的;然而，poly(I:C)未能诱导IFNB1、OAS1、RSAD2、IDO1和其他几个干扰素刺激的基因(图G、H)。

　　接着，作者通过进一步实验发现，在高水平表达NEMO-ΔEX5的成纤维细胞中，干扰素-β、干扰素-λ和促炎细胞因子IL-1α分泌减少。相反，TNF诱导的促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1α的产生未受影响(图I)。此外，HPIV3的GFP报告毒株感染患者P1、P2和P3的成纤维细胞后，与对照细胞相比，病毒蛋白表达增加(图J)。

　　结合上述实验分析，作者最终得出结论：NEMO-Δex5阻断poly(I:C)对NF-κB的激活，但未影响TNF诱导的NF-κB。

　　Fig3

　　NEMO-Δex5介导免疫细胞中的NF-κB活化和过量的I型IFN产生

　　在明确了可变剪接对靶蛋白的功能影响后，作者开始探究剪接后的靶蛋白调控的信号通路。

　　首先，作者对患者P1~P3的独立全血样本进行了RNA-Seq分析，发现在患者P1中有3条通路与干扰素和抗病毒信号有关;干扰素刺激基因在患者P1、P2和P3(其中3个样本)中表达上调，与SLE患者的表达大体相似(图A)。然后，GSEA表明，与健康对照或其他患者(即P4、P5和P7)相比，NDAS样本中的I型和II型IFN(干扰素)反应增强;干扰素评分(活性)与可变剪接之间存在显著相关性(图B、C)。

　　接着，作者又通过实验发现，与来自健康对照的细胞相比，P1的CD14+细胞和CD4+T细胞具有增强的I型IFN和STAT1磷酸化，表明IFN诱导的信号通路未受影响(图D);未分化的THP-1单核细胞系中NEMO-Δex5的表达则导致poly(I:C)诱导的p65磷酸化增加(图E);而与对照细胞相比，分化后的NEMO-Δex5重组细胞对TLR刺激的反应则更强(图F)。

　　此外，作者还发现未分化和PMA分化单核细胞NEMO-△ex5突变体都能分泌NF-κB反应的细胞因子，如IL-1β、IL-8和IL-10(图G);然后，作者用hPIV3感染原代T细胞，观察到与健康对照细胞相比，P4(NEMO-C417R)细胞对hPIV3的感染较敏感，而P1细胞不太敏感(图H)。基于此，作者认为：NEMO-Δex5介导免疫细胞中的NF-κB活化和过量的I型IFN产生。

　　Fig4

　　NEMO-Δex5和IKKi在poly(I:C)刺激下形成稳定的复合物

　　然后，作者又进行了进一步的实验，发现PMA和Poly(I:C)能诱导THP-1细胞中的内源性Ikki蛋白的表达，IKKi可由NF-κB的激活剂(如PMA)诱导;而当FL-NEMO和NEMO-Δex5都高水平表达时，NEMO-Δex5则很容易与IKKi相关(图A、B)。作者还发现，在未刺激的健康对照细胞中，FL-NEMO与IKKi相关，而poly(I:C)刺激后，IKKi相关的FL-NEMO水平有所降低;然而，在poly(I:C)处理后，P1细胞中FL-NEMO与IKKi的结合没有减少(图C、D)。

　　接着，作者发现用低分子量的poly(I:C)刺激后，在用FL-NEMO转导的细胞中，NEMO-IKKi复合物强度降低了4倍，而用NEMOΔex5转导的细胞中保持稳定的NEMO-IKKi复合物信号(图E)。另外，作者通过实验还发现，与表达FL-NEMO的细胞相比，NEMO-Δex5细胞中PLA信号的增加是由于这些细胞中的NEMO-IKKi复合物累积更多(图F、D)。基于此，作者认为：NEMO-Δex5和IKKi在poly(I:C)刺激下可以形成稳定的复合物。

　　PLA：邻位连接技术，一种高灵敏度的蛋白质检测技术

　　Fig5

　　TNF诱导IKKi表达并恢复NDAS患者成纤维细胞的抗病毒反应

　　最后，作者还研究了剪接后的靶蛋白对病毒感染的治疗作用。

　　作者通过研究参与TLR3/RLR信号通路的基因子集发现，这些基因直接或间接与NEMO相互作用(图A)。此外，还发现在成纤维细胞中，TNF和LPS都能有效地诱导IKKi蛋白的表达。相反，在RSV感染后适度诱导了IKKi蛋白的表达，而单独感染hPIV3似乎不能诱导IKKi的表达(图B)。最终，作者发现TNF恢复了poly(I:C)诱导的成纤维细胞中IFNB1的表达(图C)。

　　接着，作者通过实验观察到，在TNF存在的情况下，用hPIV3感染成纤维细胞，与健康对照细胞和P4(NEMO-C417R)的成纤维细胞相比，P1成纤维细胞中IKKi蛋白表达持续增加(图D)。而TNF的刺激显著降低了患者P1~P3细胞中hPIV3的病毒复制约30%;相反，在其他成纤维细胞或健康对照细胞中，TNF没有赋予病毒复制抗性(图E)。而来自患者P1的表达IKKi的细胞则表现出增强的抵抗hPIV3的能力。通过以上实验，最终说明，TNF可以诱导IKKi表达并恢复NDAS患者成纤维细胞的抗病毒反应。

　　研究结论：在3名患有儿童自身炎症综合征患者DNA中，检测到了缺乏外显子5编码区域的NEMO(NEMO-ΔEX5)蛋白亚型过度表达。该亚型不能与TBK1结合，当亚型水平较高时，在患者的成纤维细胞中可激活NF-κB。相比之下，表达NEMO-Δex5的免疫细胞中表现出更高的NF-κB活性和IFN产生增加。TNF刺激的成纤维细胞中NEMO-ΔΔex5与IKKi蛋白形成复合物，并诱导IKKi蛋白的表达，促进I型IFN的活化和抗病毒反应。这些研究结果揭示了缺失外显子5'端的可变剪接的IKBKG突变是如何导致一种临床表型的，在这里将其命名为NEMO缺失外显子5'端自身炎症综合征(NDAS)。

　　研究思路

　　最后，我们再来回顾一下这篇论文的整体研究思路。

　　Fig1：确定靶蛋白中可变剪接的位点

　　Fig2：探究可变剪接对靶蛋白的功能影响

　　Fig3-4：探究剪接后的靶蛋白调控的信号通路

　　Fig5：研究剪接后的靶蛋白对病毒感染的治疗作用

　　那么，可变剪接的研究思路具体应该如何设计?一般而言，蛋白的可变剪接研究包括：

　　一、确定目标蛋白是否存在可变剪接

　　二、鉴定可变剪接位点

　　三、解析可变剪接对目标蛋白的影响

　　四、探究目标蛋白可变剪接的生物学功能

　　另外，我们还为大家整理了国自然中标项目及相关文献。如果大家对可变剪接研究感兴趣的话，可以自己搜索阅读哦~