艾德思：国内科学团队开展应用CRISPR治疗肥胖症的前沿科学研究



近日,华夏源(上海)细胞基因工程股份有限机构联合上海市东方医院(同济大学附属东方医院)再生医学研究所/同济大学生命科学与技术学院/上海市第十人民医院开展了应用CRISPR治疗肥胖症的研究,并在国际学术期刊上发表了相关研究成果(参考资料[1]).本文的第一作者为华夏源CTO王志峰博士,其他作者包括同济大学生科院副院长张超教授及上海十院内分泌科主任曲伸教授等人.

研究指出,SIM1和MC4R这两条基因是对人体的食欲调节起至关重要的作用的基因,它们在中枢神经系统中表达.当SIM1或MC4R其中一条基因发生突变导致功能丧失时,剩余的另一条基因所产生的蛋白量将不足以弥补基因突变带来的影响,即生物学上所述的单倍剂量不足(haploinsufficiency),相应人群将控制不住自己的食欲,引起肥胖.SIM1是神经元分化和下丘脑室旁核(PVN)功能所必需的因子,在食物摄入和能量稳态中起着重要作用.如果SIM1单倍剂量不足(两个基因拷贝中的一个功能丧失),将会发展为早期肥胖伴随着线性增长增加/食欲过盛/高胰岛素血症和高瘦素血症等症状,但能量消耗没有变化.相反,下丘脑SIM1过度表达则会引起动物摄食减少,进而抑制饮食诱导的肥胖症.MC4R是一种在下丘脑中表达的G蛋白偶联受体(GPCR),在食欲控制和能量稳态中起重要作用.在下丘脑PVN区谷氨酸能SIM1神经元上表达的MC4R对于体重调节十分重要.MC4R的单倍剂量不足会导致人体过度肥胖,而小鼠中MC4R的单倍体失活则会导致过度摄食引起的肥胖.

面对这一现象,研究提出了以一种新的解决思路.这些肥胖患者之所以控制不了食欲,是因为SIM1或MC4R的表达不足,如果能提高这些基因的表达剂量,人体就能重新恢复控制食欲的能力.研究人员希望通过CRISPR增强SIM1或MC4R基因表达以治疗单倍剂量不足引起的肥胖综合症.

CRISPR-Cas9最初被描述为细菌中的一种适应性免疫系统,现已被开发为用于基因组编辑的RNA引导的内切核酸酶.作为继巨核酸酶/锌指核酸酶(ZFN)和转录激活物样效应物核酸酶(TALENs)之后的第四代基因编辑方式,该系统也同时被广泛用于进行特定基因"功能损失'和"功能获得'的遗传研究,以确定该基因在细胞或动物中的作用.内源基因转录调控可以通过转录激活因子样效应物(TALE)或锌指(ZFs)与转录调控因子融合来实现.尽管其具有有效性,TALE和ZFs工具的开发需要复杂和耗时的组装步骤.基于CRISPR-Cas9的新兴应用包括将催化失活的Cas9(dCas9)融合到蛋白质域以调节转录的技术.单一导向RNA(sgRNA)将dCas9融合蛋白靶向特定DNA区段,如启动子和增强子,其可以根据融合DNA盒的性质导致转录的激活(CRISPRa)或干扰(CRISPRi).Rosa26敲入结构与Cre/LoxP重组系统结合,在特定组织中实现了外源基因的条件性过度表达,并允许超大型片段(20-30kb)的位点特异性整合.该系统通常需要复杂的敲入操作和多次杂交以产生所需的小鼠品系,从而严重影响系统效率.基于细菌人工染色体(BAC)的随机转基因作为在动物模型中过表达特定基因的替代方式,可以快速有效地获得小鼠的转基因创建.由于基因盒整合到一个随机位点,该技术可能导致不需要的突变,插入位点侧翼的基因可能无法预测.幸运的是,CRISPRa / dCas9系统具有克服上述这些障碍的潜力.大量研究表明,CRISPRa系统能够非常有效且易于定制地实现基因表达或纠正引起疾病的突变,因此对人类疾病的治疗具有潜在的应用价值.尽管如此,CRISPRa系统仍有很大的空间来进一步改进和扩展.脱靶导致的意外突变是关于CRISPRa系统治疗应用的首要关注点.另一个关键的问题是怎样有效地将CRISPR-Cas9靶向导入到难以感染或转染的组织或细胞中.重组腺相关病毒(rAAV)因其高效持久的转基因表达,较低的免疫原性以及没有随机基因组插入的非整合特征而成为最常用的CRISPR-Cas9导入载体.

CRISPR-Cas9已被广泛用于体细胞的生物医学工程,并且在体外细胞和体内动物模型中被证明是一种有潜力的治疗遗传疾病的工具.例如,它可以通过纠正导致杜氏肌营养不良症(DMD)的突变来恢复心肌和骨骼肌中肌营养不良蛋白的表达.在心血管疾病的情况下,CRISPR可以通过在体内纠正肝细胞中的PCSK9基因突变来大幅降低血清PCSK9和总胆固醇水平.此外,体内CRISPR-Cas9通过在常染色体显性视网膜色素变性大鼠模型中选择性删除S334ter突变来预防遗传性视网膜变性.重要的是,CRISPR-Cas9系统正在被积极探索用于治疗获得性疾病,如癌症,HIV和乙型肝炎等.然而,目前还没有通过CRISPR-Cas9系统成功校正体内肥胖相关突变的报道.

CRISPR有望增强特定基因的表达(图片来源:参考资料[2])

全球众多科学团队都对这一机理展开了研究,之前在期刊发表了一篇题为"CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency'的文章,揭示了一种利用CRISPR系统以逆转严重肥胖(severe obesity)的方式,并公开了相关动物实验的数据.

研究人员利用CRISPRa/dCas9系统将小鼠模型中单倍不足基因SIM1和MC4R的表达恢复到生理水平.与传统的基因组编辑纠正致病DNA突变不同,本研究将VP64(一种通用的中度转录激活因子)与核酸酶缺陷型Cas9(dCas9)融合以靶向剩余功能SIM1基因的非编码基因组区,即启动子或增强子,从而向上调节内源性SIM1基因表达.为了检验该方式的特异性和有效性,研究使用携带spdCas9-VP64的转基因动物,以及rAAV介导的pCMV-spdCas9-VP64直接递送到下丘脑的PVN中.在这两种情况下,下丘脑SIM1表达恢复到正常水平,从而治疗了肥胖综合症.此外,下丘脑转录组和ChIP-seq分析均显示500kb窗口内没有SIM1邻近基因的差异表达,证明了该方式的高特异性.将基于rAAV包装的CRISPRa注射到MC4R单倍剂量不足小鼠的下丘脑中同样可以纠正肥胖表型,进一步证明了该方式的有效性.

研究人员指出,这种肥胖症基因调控机制未来除了可以治疗单倍剂量不足的肥胖症,也可以用于其他疾病.据估计,有600多条基因会出现"单倍剂量不足'的现象,这些现象是各种疾病的发病机理.同时,CRISPR技术有望给患者带来转机,该研究提出的基因增强治疗思路不会对基因组带来永久性的改变,避免了脱靶风险.CRISPR可以针对启动子或增强子区域,而不直接针对基因本身.因此,它有望将作用于特定的组织区域,进一步降低治疗风险.

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